【摘要】目的:初步研究非綜合征性唇腭裂患者可能存在的代謝機(jī)制，同時(shí)探討基于核磁共振(NMR)的代謝組學(xué)技術(shù)在臨床應(yīng)用中的可行性。方法:分別收集10例非綜合征性唇腭裂患者和10例正常人的血漿，在核磁共振儀上對血漿樣本進(jìn)行采樣，獲得一系列原始的一維NMR譜圖，然后使用MESTRE-v4.7軟件對NMR譜圖進(jìn)行積分簡化數(shù)據(jù)，將譜圖分解成212個(gè)區(qū)域進(jìn)行積分，得到積分強(qiáng)度，利用SIMCA-P11.0軟件對積分強(qiáng)度進(jìn)行主成分分析。結(jié)果:非綜合征性唇腭裂患者和正常人的血漿代謝存在差異，至少存在3種不同的代謝產(chǎn)物，分別為三羥丁酸γ甲基類物質(zhì)、精氨酸和纈氨酸。非綜合征性唇腭裂患者血漿代謝產(chǎn)物以纈氨酸和三羥丁酸γ甲基類物質(zhì)為主，而正常人血漿代謝產(chǎn)物則以精氨酸為主。結(jié)論:通過代謝組學(xué)技術(shù)，可以初步探討非綜合征性唇腭裂患者的代謝機(jī)制，同時(shí)該技術(shù)有望應(yīng)用于臨床。

【關(guān)鍵詞】代謝組學(xué);非綜合征性唇腭裂;主成分分析

非綜合征性唇腭裂是口腔頜面部最常見的先天性發(fā)育畸形，占整個(gè)頜面部面裂畸形的70%以上。該病發(fā)病因素復(fù)雜，對其病因?qū)W的研究意義重大。若能明確其發(fā)病原因，并采取有效的干預(yù)措施，有望從根本上預(yù)防該疾病的發(fā)生。目前，對唇腭裂的病因?qū)W研究取得了一定的進(jìn)展，如發(fā)現(xiàn)唇腭裂是多因素遺傳疾病，與孕期吸煙、用藥等因素有關(guān)等^①③，但其確切的代謝機(jī)制和發(fā)病原因尚不清楚。本文通過研究非綜合征性唇腭裂患者血漿的代謝機(jī)制，推斷其潛在的發(fā)病原因，同時(shí)探討基于核磁共振(nu-clearmagneticresonance，NMR)的代謝組學(xué)在臨床應(yīng)用中的可行性。

1、材料和方法

1.1 試驗(yàn)儀器

本試驗(yàn)使用的主要儀器有：BrukerAvanceDRX600核磁共振儀(Bruker公司，德國);XYJ80-2低速離心機(jī)(江蘇金壇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);MR1812高速離心機(jī)(Jouan公司，法國);4mL肝素鈉抗凝管(BectonDickinson公司，美國);FD-1冷凍干燥機(jī)(北京博康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 研究對象的選擇

隨機(jī)選擇2004—2005年在四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院唇腭裂外科行手術(shù)治療的非綜合征性唇腭裂患者10例作為病例組，其中單純性腭裂患者6例，唇裂并發(fā)腭裂患者4例;女性8例，男性2例;年齡6～19歲，平均年齡(12.6±6.5)歲。同時(shí)隨機(jī)選擇2004—2005年在四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心婦幼保健院查體的健康人10例作為對照組，女性8例，男性2例;年齡7～20歲，平均年齡(13.0±5.1)歲。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷為非綜合征性唇腭裂的患者，無其他系統(tǒng)性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)患有綜合征性唇腭裂如Shprintzen綜合征或Robbin綜合征者;2)患有先天性代謝缺陷

如楓糖尿癥患者;3)臨床生化結(jié)果異常者，或者患有血液系統(tǒng)疾病者;4)傳染病患者如獲得性免疫缺陷綜合征、B或C型肝炎等^④⑤。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集及處理 樣本采集前，2組研究對象要求空腹6h。樣本采集于上午9時(shí)左右在室溫下進(jìn)行。抽取研究對象靜脈血液4mL，緩慢注入4mL肝素鈉抗凝管中，室溫下1500r/min低速離心10min，以去除全血中血細(xì)胞等大分子物質(zhì)。離心后用移液槍吸取上清液(即血漿)2mL放入EP管內(nèi)，進(jìn)行二次離心(4℃下20000r/min離心10min)，以去除血漿中的雜質(zhì)，保留血漿中的小分子代謝物質(zhì)。離心后吸取上清液1.8mL放入干凈的EP管內(nèi)，將樣本進(jìn)行凍干處理，然后保存在-20℃低溫冰箱中備用。

1.3.2 NMR數(shù)據(jù)的采集 將凍干處理過的血漿樣本在室溫下解凍，將450μL解凍樣本移入干凈的核磁管內(nèi)，以體積比1∶10的比例緩慢加入重水至500μL，混勻，靜置5min。每個(gè)樣本制備完成后直接在核磁共振儀上進(jìn)行光譜采集，獲得原始的一維氫譜。光譜采集在室溫下進(jìn)行，采樣點(diǎn)數(shù)是32k，累加次數(shù)128次，核磁共振儀實(shí)際工作頻率為600.13MHz。掃描對水峰進(jìn)行抑制的原始一維氫譜，可以獲得

131072個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，其峰寬度為7788.16Hz，最小頻率為-1073.15Hz。掃描未進(jìn)行水峰抑制的氫譜同樣可獲得131072個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，其峰寬度為7183.91Hz,最小頻率為-651.29Hz。

1.3.3 NMR數(shù)據(jù)后加工過程和化學(xué)計(jì)量分析方法 所有樣本的自由感應(yīng)衰減(freeinductiondecay，F(xiàn)ID)信號導(dǎo)入MESTRE-v4.7軟件進(jìn)行傅里葉轉(zhuǎn)換(Fouriertransform，F(xiàn)T)，獲得一維NMR譜圖，將所獲得的譜圖進(jìn)行基線調(diào)整。由于δ4.52～6.00含有水峰^⑥⑦，該區(qū)域的化學(xué)位移被排除在外。將各個(gè)樣本的氫譜δ0～4.52及δ6～10按bin0.04為單位進(jìn)行分割，得到212個(gè)化學(xué)位移值段，進(jìn)一步按各化學(xué)位移值段分別積分，即得到與各個(gè)化學(xué)位移值段相對應(yīng)的積分值，這樣就簡化了原始數(shù)據(jù)(圖1)。對每個(gè)樣本進(jìn)行光譜采集，可獲得20組數(shù)據(jù)，構(gòu)成1個(gè)n×d二維矩陣(其中n為樣本組數(shù)，d為積分區(qū)間數(shù))，這樣更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel文件中備用。使用SIMCA-P11.0軟件對該二維矩陣進(jìn)行化學(xué)計(jì)量處理，主要進(jìn)行主成分分析(principalcompo-nentanalysis，PCA)。

2、結(jié)果

本研究中所建立的新變量模型含有9個(gè)主成分(principalcomponent，PC)，前2個(gè)主成分(PC1和PC2)的累積貢獻(xiàn)率為93.5%，說明所建立的變量具有很好的預(yù)測性。前2個(gè)主成分的PC圖見圖2。由圖2可以看出，對照組樣本間變異較大，病例組樣本間則具有高度相似性，但這2個(gè)主成分不能完全區(qū)分2組的樣本。第2和第3個(gè)主成分(PC2和PC3)的PC圖見圖3，這2個(gè)主成分可以區(qū)分病例組和對照組，因此筆者選用PC2和PC3作為研究對象。圖4為PC2和PC3的因子負(fù)荷圖，可見圖中大多數(shù)點(diǎn)集中于原點(diǎn)，表現(xiàn)為重疊點(diǎn)，即具有相同的代謝產(chǎn)物，也就是說病例組和對照組具有相同的代謝產(chǎn)物;但是有少數(shù)的點(diǎn)遠(yuǎn)離原點(diǎn)，這些點(diǎn)所代表的化合物造成了某些樣本間血漿代謝物的差異，主要表現(xiàn)為氨基酸及脂類物質(zhì)的異常代謝。對這些異常代謝物作進(jìn)一步分析，引起這種差異的代謝物的NMR峰主要集中在δ1.20、δ1.80、δ3.60(圖4)。對發(fā)生變化的NMR譜峰進(jìn)行分析，這些化學(xué)位移值分別代表一些氨基酸及脂類物質(zhì)，如精氨酸、纈氨酸和三羥丁酸γ甲基類物質(zhì)等^⑥⑧。對照組血漿代謝產(chǎn)物中以精氨酸為主，而病例組血漿代謝產(chǎn)物則含有三羥丁酸γ甲基類物質(zhì)和纈氨酸。

3、討論

先天性唇腭裂危害著口腔頜面器官的形態(tài)及功能，嚴(yán)重影響了出生人口素質(zhì)及母嬰身心健康。從遺傳學(xué)上，該疾病可分為綜合征性唇腭裂與非綜合征性唇腭裂，其中非綜合征性唇腭裂最為多見。非綜合征性唇腭裂是一個(gè)復(fù)雜的、由遺傳和環(huán)境因素相互作用所致的疾病，其代謝產(chǎn)物可能會出現(xiàn)異常表達(dá)。本研究運(yùn)用代謝組學(xué)對10例非綜合征性唇腭裂患者和10例正常人進(jìn)行分析，初步了解非綜合征性唇腭裂患者的代謝機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非綜合征性唇腭裂患者和正常人在血漿代謝產(chǎn)物上存在差異，其差異主要表現(xiàn)在某些氨基酸的異常代謝上，如精氨酸和纈氨酸。正常人血漿代謝產(chǎn)物中以精氨酸為主，而非綜合征性唇腭裂患者血漿代謝產(chǎn)物則含有三羥丁酸γ甲基類物質(zhì)和纈氨酸。精氨酸是鳥氨酸循環(huán)中的重要組成成分，具有極其重要的生理功能，在嬰幼兒發(fā)育中起著重要的作用，若缺乏則不能維持嬰幼兒正常的生長與發(fā)育。纈氨酸為必需氨基酸，作用于黃體、乳腺及卵巢，其功能主要是維持神經(jīng)系統(tǒng)功能正常。三羥丁酸γ甲基類物質(zhì)在血漿中表現(xiàn)為低密度脂蛋白，在某些腫瘤患者血漿中表現(xiàn)為高表達(dá)的巖藻糖甲基脂蛋白。

本研究結(jié)果提示，運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)可以早期篩查某種疾病并探討其代謝機(jī)制，也說明在此基礎(chǔ)上推斷其潛在的發(fā)病原因是可行的。但本研究僅僅在技術(shù)方法上進(jìn)行了一些探索，得出了部分有意義的結(jié)果，在下一步工作中，筆者擬從兩方面進(jìn)行深入的研究：一方面嚴(yán)格控制受試者的飲食，主要是禁止食用含有魚肉和櫻桃等食品，因?yàn)榇x組學(xué)容易受到飲食習(xí)慣、生活方式和文化差異等因素的影響;另一方面應(yīng)擴(kuò)大樣本含量，使其更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究生物體液最有效和全面的方法是對其基因、蛋白質(zhì)表達(dá)水平和代謝濃度同時(shí)進(jìn)行監(jiān)測。如何把代謝組學(xué)數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、遺傳學(xué)、酶學(xué)、代謝途徑和表現(xiàn)型分析的數(shù)據(jù)整合在一起，并給出生物學(xué)功能的解釋是很艱巨的任務(wù)。它們的整合除了需要適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)庫外，還需要多種先進(jìn)的數(shù)學(xué)分析方法。隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)認(rèn)識的不斷深入和研究工作的不斷積累，這些技術(shù)必將會越來越廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究之中。

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