【摘要】目的：探討中藥單體欖香烯(effectsofe lemene,Ele)對人晶狀體上皮細(xì)胞系(humanlen sepithelialcellsB3,HLE B3)內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白合成的影響。方法：利用10μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子(recombinanthuman basicfibro blastgrowth factor,rhbFGF)誘導(dǎo)HLE B3增殖，將80mg/L的Ele作用在處于增殖狀態(tài)下的HLE B3，24h后采用雙抗體夾心ABC 酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme linkedimmuno sorbentassay,ELISA)檢測Ele作用后HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)。結(jié)果：rhbFGF作用后HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白濃度為53.5±5.4μg/L，較正常組(38.5±2.3μg/L)明顯升高，Ele作用后HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白的濃度為29.5±2.9μg/L，較rhbFGF組明顯下降(P<0.01)。rhbFGF作用后HLE B3內(nèi)Ⅲ型膠原蛋白濃度為1.27±0.29μg/L，較正常組(0.83±0.12μg/L)明顯升高，Ele作用后HLE B3內(nèi)Ⅲ型膠原蛋白的濃度為0.69±0.11μg/L，較rhbFGF組明顯下降(P<0.01)。結(jié)論：Ele抑制rhbFGF誘導(dǎo)的HLE B3增殖的同時(shí)也能抑制HLE B3內(nèi)Ⅰ，Ⅲ型膠原蛋白合成，干擾HLE B3纖維化，可望成為防治后囊膜混濁的理想藥物。

【關(guān)鍵詞】欖香烯晶狀體;上皮細(xì)胞后囊膜混濁;Ⅰ型膠原蛋白;Ⅲ型膠原蛋白

引言

膠原蛋白(collagen)或稱膠原，是動物細(xì)胞合成的一種生物性高分子，是一類最主要的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)。目前的研究表明，ECM與后囊膜混濁的關(guān)系密切：ECM是構(gòu)成纖維化性混濁的重要成分。免疫電鏡檢查顯示混濁的晶狀體后囊膜的纖維有Ⅰ，Ⅲ和IV型膠原;此外ECM還可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化及細(xì)胞運(yùn)動。欖香烯(elemene，Ele)是天然藥物莪術(shù)的主要成分，具有抗血栓形成、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡^①②，我們的研究發(fā)現(xiàn)Ele能抑制由重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(recombinant human basicfibro blastgrowth factor,rhbFGF)誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞系(humanlensepithelialcellsB3,HLE B3)增殖(另文報(bào)道)，我們進(jìn)一步采用雙抗體夾心ABC酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme linke dimmunosorbentassay，ELISA)檢測Ele作用后HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白(collagenI)和Ⅲ型膠原蛋白(collagenIII)表達(dá)，探討Ele是否在抑制HLE B3增殖的同時(shí)還能抑制HLE B3內(nèi)Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白的合成，從而對阻止晶狀體上皮細(xì)胞纖維化起重要的作用。

1、材料和方法

1.1 材料

人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE B3由廣州中山大學(xué)眼科研究中心提供;Ele乳液，純度99.0%，大連金港制藥有限公司;rhbFGF為英國PeproTech公司;DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和EDTA分別是美國Gibco公司、美國Amresco公司和美國Augus公司;Ⅰ型膠原蛋白(collagenI)和Ⅲ型膠原蛋白(collagenIII)的ELISA試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供。自動酶標(biāo)讀數(shù)儀：美國BioTekELX808;倒置研究顯微鏡：日本IMT 413;二氧化碳培養(yǎng)箱：美國FORMA2111。取出保存凍存細(xì)胞的凍存管立即放入37℃水中，將溶解的細(xì)胞懸液用10倍體積以上的培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，離心，除上清，反復(fù)洗滌3次。以5×108個(gè)/L接種于培養(yǎng)瓶中，37℃，50mL/LCO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長融合后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2 方法

80mg/LEle作用24h后收集細(xì)胞上清液;取出已經(jīng)包被了抗人Ⅰ，Ⅲ型膠原蛋白單克隆抗體的96微孔板。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)稀釋液100mL，第1孔加標(biāo)準(zhǔn)品100μL，均勻后用加樣器吸出100μL，移至第2孔。如此反復(fù)作對倍稀釋至第7孔，最后從第7孔中吸出100μL棄去，使之體積均為100μL，第8孔為空白組。待測品孔每孔各加入細(xì)胞上清液100μL，每組6個(gè)孔;將反應(yīng)板充分混勻后置37℃，120min;用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌5次，在濾紙上印干;每孔加第一抗體工作液50μL，置37℃，60min;同前洗板后每孔加酶標(biāo)抗體工作液100μL，置37℃，60min;同前洗板后每孔加底物工作液100μL，置37℃暗處反應(yīng)10min;每孔加50μL終止液混勻。在492nm處測吸光度值;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品A值畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品A值在該曲線圖上查出相應(yīng)的Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白含量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2、結(jié)果

rhbFGF組HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白含量較空白組明顯增加，與空白組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01;Ele組HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白含量較rhbFGF組明顯下降，與rhbFGF組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說明Ele能降低HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白含量。rhbFGF組HLE B3內(nèi)Ⅲ型膠原蛋白含量較空白組明顯增加，與空白組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);Ele組HLE B3內(nèi)Ⅲ型膠原蛋白含量分別較rhbFGF組明顯下降，與rhbFGF組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說明Ele能降低HLE B3內(nèi)Ⅲ型膠原蛋白含量。Ele對HLE B3內(nèi)Ⅰ，Ⅲ型膠原蛋白含量的影響

3、討論

膠原蛋白或稱膠原，是動物細(xì)胞合成的一種生物性高分子，是ECM中最主要的一類物質(zhì)。經(jīng)過數(shù)十年來的研究和發(fā)展,業(yè)已發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)了膠原蛋白有25種類型，其中Ⅰ，Ⅲ型膠原蛋白約占膠原蛋白總量的80%～90%。膠原蛋白纖維化是許多疾病的病理表現(xiàn)之一，膠原蛋白分子的異常合成和沉積是纖維化反應(yīng)的基礎(chǔ)。如彌漫性肺纖維化早期表現(xiàn)為肺泡炎，后期為彌漫性肺間質(zhì)纖維化,主要是肺間質(zhì)中成纖維細(xì)胞數(shù)及其產(chǎn)生的膠原蛋白和其他結(jié)締組織成分增多，肺泡壁遭破壞，特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化時(shí)，肺組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原增高，肺臟變硬，順應(yīng)性減退^③。有研究表明，高血壓左心室肥厚時(shí)不僅存在心肌肥大的變化，心肌間質(zhì)纖維化亦是重要的病理改變，Ⅰ,Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)增強(qiáng),促進(jìn)了間質(zhì)的纖維化^④。ECM是構(gòu)成纖維化性混濁的重要成分。免疫電鏡檢查顯示混濁的晶狀體后囊膜的纖維有Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型膠原，ECM可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化及細(xì)胞運(yùn)動。纖維粘連蛋白等ECM可促進(jìn)某些黏附分子磷酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞移行。白內(nèi)障摘除術(shù)后，殘留的晶狀體上皮細(xì)胞通過細(xì)胞膜上的黏附分子與細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白相連，促使細(xì)胞移行并發(fā)生晶狀體后囊膜皺縮。Ishida等^⑤研究發(fā)現(xiàn)：米諾地爾能抑制體外培養(yǎng)的晶狀體上皮細(xì)胞的增殖、移行及膠原分泌。張鳳妍等^⑥探討表皮生長因子、白細(xì)胞介素1、干擾素和生長抑素8肽在晶狀體后囊膜混濁形成中的作用及影響膠原合成的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)表皮生長因子、白細(xì)胞介素1參與晶狀體后囊膜混濁形成時(shí)的膠原合成，干擾素和生長抑素8肽的作用提示其可用于防治晶狀體后囊膜混濁。在本研究中，10μg/LrhbFGF作用后，HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白濃度為53.5±5.4μg/L，較正常組(38.5±2.3μg/L)明顯升高，說明rhbFGF能促進(jìn)HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白的合成。經(jīng)Ele作用后，HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白的濃度為29.5±2.9μg/L，較rhbFGF組明顯下降。結(jié)果提示，Ele能抑制HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白的合成。我們還發(fā)現(xiàn)，10μg/LrhbFGF作用后，HLE B3內(nèi)Ⅲ型膠原蛋白濃度為1.27±0.29μg/L，較正常組(0.83±0.12μg/L)明顯升高，說明rhbFGF能促進(jìn)HLE B3內(nèi)Ⅲ型膠原蛋白的合成。經(jīng)Ele作用后，HLE B3內(nèi)Ⅲ型膠原蛋白的濃度為0.69±0.11μg/L，較rhbFGF組明顯下降。本結(jié)果提示，Ele能抑制HLE B3內(nèi)Ⅲ型膠原蛋白的合成。本結(jié)果提示，rhbFGF在促進(jìn)HLE B3增殖的同時(shí)，也能促進(jìn)HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白的合成;Ele能有效抑制HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白的合成。進(jìn)一步說明作為ECM重要成分的Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白，是構(gòu)成纖維化性混濁的重要原因，也是導(dǎo)致晶狀體后囊膜纖維化并發(fā)生混濁的重要機(jī)制。Ele有望成為防治后發(fā)性白內(nèi)障的有效藥物。

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