【摘要】目的:聯合應用免疫熒光細胞化學技術和激光掃描共聚焦顯微鏡技術(LSCM)檢測腦脊液中腦膜癌細胞CEA的表達部位并定量測定其熒光含量，探討該技術在腦膜癌病診斷中的價值。 方法:應用免疫熒光細胞化學法以CEA標記腦膜癌細胞及對照組腦脊液細胞，采用LSCM技術獲得腦膜癌細胞掃描圖像并定量測定CEA熒光強度值。結果:腦脊液中腦膜癌細胞的CEA表達為陽性，且部位在細胞漿中;CEA平均熒光值(36.80±17.17)，與對照組(4.87±1.86)相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論:聯合應用免疫熒光細胞化學法和LSCM檢測腦脊液細胞中CEA的表達可為腦膜癌病的診斷提供可靠依據。

【關鍵詞】腦膜癌病;腦脊液;CEA;激光掃描共聚焦顯微鏡;免疫熒光

本研究聯合應用免疫熒光細胞化學技術和激光掃描共聚焦顯微技術對20例腦膜癌病(meningealcarcinomatosis,MC)患者的腦脊液細胞進行綠色熒光平均值(CEA)檢測，以探討該方法在MC診斷中的價值。

1、材料與方法

1.1 標本來源：20例MC患者為2007年8月至2008年8月本院、南京腦科醫(yī)院門診及住院收治。男9例，女11例，平均年齡51歲。按腫瘤來源：肺腺癌10例、乳腺癌2例、絨毛膜癌1例、子宮內膜癌1例、惡性髓母細胞瘤2例、未找到原發(fā)病灶4例。16例轉移癌病例均由組織病理證實。對照組20例均為同期本院神經內科住院收治，經腦脊液細胞學診斷為病毒性腦膜炎且隨訪已治愈。男8例，女12例，平均年齡41歲。

1.2 試劑與儀器：兔抗人CEA、FITC-羊抗兔IgG均購自北京博奧森生物技術公司;Cytospin-3型細胞玻片離心儀，英國Shandon公司生產;TCS-SP5型激光共聚焦掃描顯微鏡，德國Leica公司生產，第三軍醫(yī)大學提供使用。

1.3 方法

1.3.1 CEA標記：設肺腺癌胸水陽性對照組、PBS自發(fā)熒光對照組、PBS+二抗熒光標記物對照組。標本玻片以10%羊血清封閉30min，滴加1∶100兔抗人CEA，置濕盒內37℃孵育1h,4℃過夜，再加入1∶20FITC-羊抗兔IgG,避光置濕盒內37℃孵育1h，滴加1∶1000DAPI室溫10min，甘油封片，以上每步驟間均以0.01MPBS漂洗3遍。

1.3.2 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察：分別用488nm和405nm波長的激光器激發(fā)綠色和藍色熒光。CEA相對熒光含量檢測結果以平均熒光值和熒光強度地形立體分布圖表示。實驗組及對照組各隨機選取200個高倍鏡視野的細胞，測定每個細胞內CEA含量的相對熒光值及細胞面積、周長。

1.4 統(tǒng)計學方法：本實驗采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2、結果

2.1 LSCM掃描熒光圖像及CEA的表達部位：腦膜癌細胞的胞漿內可見分布均勻的綠色熒光，CEA表達于胞漿;其余淋巴、單核細胞等僅見DAPI染色的藍色細胞核，胞漿未著色。對照組腦脊液細胞僅見藍色的細胞核，胞膜、胞漿及胞核內未見綠色熒光，提示無CEA表達

2.2 CEA熒光強度地形立體分布圖：腦膜癌細胞圖像為不規(guī)則的蛋糕形，中心凹陷呈火山口狀，底部可見藍色細胞核區(qū)域;胞漿區(qū)域呈環(huán)形，頂端不平坦，黃、紅色山峰呈鋸齒樣突起，相對熒光含量由低到高(0→255)藍→綠→黃→紅。對照組腦脊液細胞地形平坦，僅見藍色腎形細胞核區(qū)域，胞漿基本無熒光分布，單核細胞。

2.3 腦膜癌細胞與對照組腦脊液細胞CEA熒光相對含量及形態(tài)學參數比較：腦膜癌細胞與對照組腦脊液細胞CEA熒光含量相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，腦膜癌細胞的面積、周長與對照組腦脊液細胞相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

兩組腦脊液細胞EMA/CEA熒光相對含量及形態(tài)學參數的比較

3、討論

MC是由于惡性腫瘤在蛛網膜下腔和軟膜內彌漫性轉移而引起的一系列臨床綜合征，在癌癥患者中發(fā)生率為5%-8%，目前有上升趨勢[1]。肺癌、乳腺癌、胃腸道癌是腦膜癌最常見的原發(fā)灶，腺癌是其主要組織類型[2]。腦膜癌病臨床表現復雜，在腦脊液中找到腦膜癌細胞是診斷本病的最終標準[3]。據報道[4]MC患者首次腰穿發(fā)現腫瘤細胞的陽性率僅為45%-60%。

劉振華等[5]報道常規(guī)CSF細胞學發(fā)現腫瘤細胞的陽性率為41.86%，應用CEA免疫細胞化學法可將陽性率提高到83.72%。Liu等[6]報道CEA等上皮來源的標記物在腦膜癌組的陽性例數為80%，在良惡性腦膜瘤組為0%，提示多抗體免疫組化檢測可鑒別腫瘤細胞的組織來源。本實驗MC組CEA陽性率為90%(18/20);常規(guī)MGG染色陽性率60%(12/20)，兩者相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示免疫細胞化學染色可顯著提高腦膜癌病的診斷率，與國內外研究一致。Martínez等[7]應用免疫熒光雙標和LSCM技術對腦膜血管外皮細胞瘤中的抑癌基因進行了研究。岳劍寧等[8]用LSCM對腦脊液淋巴白血病細胞線粒體進行了立體、定量研究。LSCM觀察可見細胞核與DAPI結合呈明亮的藍色熒光，未見綠色熒光，提示胞核內無CEA表達;胞漿內可見分布均勻的明亮的綠色熒光，提示CEA表達于胞漿，與國內外報道一致[9]。從熒光強度地形立體分布圖可見腦膜癌細胞胞核CEA含量極少，而胞漿內CEA含量較高，亦與上述分布相符。對照組細胞面積和周長相對較小，胞漿內CEA含量極低;而腦膜癌細胞面積和周長相對較大，胞漿內CEA含量較高，兩組之間相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。本實驗MC組中2例髓母細胞瘤檢測CEA陰性，與文獻報道一致[10]。

【參考文獻】

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[3]N.Pavlidis.The diagnostic and therapeutic management of leptomeningeal carcinomatosis [J].Ann Oncol,2004,15 (Supplement 4):285-291.

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[7]Martinez JC,Palomino JC,Samaniego R,et al.Retinoblastoma (Rb) tumor-suppressor pathway alterations in meningeal hemangiopericytomas:High E2F transcription factor 1 expression and loss of Rb expression:study by double immunofluorescence staining and laser-scanning confocal microscopy [J].Cancer,2008,113(1):166-174.

[8]岳劍寧,孔繁元,吳若芬,等.應用共聚焦激光掃描顯微鏡對腦脊液淋巴白血病細胞線粒體的研究[J]. 北京醫(yī)學,2005,27(4):211-213.

[9]Susanne J,Monica EK,Britta W,et al.Intracellular Targeting of CEA Results in Th1-Type Antibody Responses Following Intradermal Genetic Vaccination by a Needle-Free Jet Injection Device [J].The Scientific World,2007,7:987-999.

[10]鄭繼培,何澤生,余英豪.小腦蚓部髓母細胞瘤椎管內轉移1例[J].中國誤診學雜志,2006,6(7):1414.