【摘要】目的：研究牙周病患牙累及的牙根面經(jīng)EDTA脫礦和富血小板血漿(PRP)單獨(dú)及聯(lián)合處理后對人牙周膜成纖維細(xì)胞附著、增殖的影響。方法：以因牙周病不能保留而拔除的患牙制備的牙根片為對照組，PRP和EDTA脫礦單獨(dú)及聯(lián)合處理患牙根片為實(shí)驗(yàn)組，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法及四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色實(shí)驗(yàn)分析人牙周膜成纖維細(xì)胞在病變根面上的附著和增殖。結(jié)果：未處理組的根片上有少量的細(xì)胞附著;根片經(jīng)PRP或EDTA脫礦單獨(dú)處理能明顯增加細(xì)胞的附著(P<0.05);二者聯(lián)合處理促附著效果明顯增強(qiáng)(P<0.01)。未處理組根片上生長的細(xì)胞隨時(shí)間延長數(shù)量反而下降;經(jīng)PRP或EDTA單獨(dú)處理的根片上的細(xì)胞有少量的增殖(P>0.05);二者聯(lián)合處理細(xì)胞增殖明顯(P<0.05)。結(jié)論：EDTA根面脫礦和PRP能有效促進(jìn)人牙周膜成纖維細(xì)胞在牙周病患牙根面上的附著和增殖。

【關(guān)鍵詞】富血小板血漿 牙周膜成纖維細(xì)胞;附著 增殖

牙周病患牙根面存在各種毒素已成共識(shí)，根面平整、脫礦處理可有效地去除病變根面上的內(nèi)毒素、殘留致炎物質(zhì)等玷污層，從而有利于細(xì)胞附著、生長，促進(jìn)新附著的形成。枸櫞酸、四環(huán)素及各種生長因子等可用于根面處理，但臨床應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)根面用pH值為1的枸櫞酸處理并無更多的新附著形成^①。富血小板血漿(platelet richplasma,PRP)含有豐富的生長因子，以轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)和血小板源性生長因子(plateletderivedgrowthfactor，PDGF)含量較高，能促進(jìn)體外培養(yǎng)的牙周膜成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖和膠原的形成^②，Lekovic等^③將PRP、牛骨粉聯(lián)合應(yīng)用治療慢性牙周炎骨缺損患者，取得較好的效果，劉琪等^④研究表明經(jīng)PRP處理的生物降解膜能明顯增強(qiáng)鼠牙周膜成纖維細(xì)胞的附著和增殖。但用EDTA和PRP處理牙周炎患牙的根面能否促進(jìn)人牙周膜成纖維細(xì)胞(periodontalligamentfibroblast，PDLF)的附著和增殖，目前國內(nèi)尚未見報(bào)道。本研究旨在觀察PDLF在EDTA脫礦和PRP單獨(dú)及聯(lián)合處理病變根面上的附著和增殖，為其在牙周治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 材料

選擇年齡在12～30歲因正畸或阻生拔出的患牙，X線顯示無根尖病變、無牙槽骨吸收且牙齦正常者做牙周膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng);選擇因重度牙周病拔除的患牙制備牙根片。

1.2 方法

1.2.1 牙周膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)收集附著在牙根面的牙周膜組織，將其剪成1mm×1mm大小,移入25mL的培養(yǎng)瓶內(nèi),加入少量的含20%小牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素、20mmol/LHepes的DMEM培養(yǎng)液,將培養(yǎng)瓶直立于37℃、5%CO2飽和濕度的孵箱內(nèi)，4～8h后倒瓶，使培養(yǎng)液充分浸沒組織塊，3d換液1次，直至傳代，待細(xì)胞貼滿瓶底80%左右時(shí)即行傳代培養(yǎng)，取第5～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 牙周炎患牙牙根片的制備牙齒拔除前標(biāo)記釉牙骨質(zhì)界至牙周袋底的區(qū)域,即牙周病累及的根面區(qū)，拔除過程中注意不損傷根面，拔除后用生理鹽水沖洗，用刮治器刮凈附在根面上的物質(zhì)，在冷水冷卻的條件下用金剛砂片將牙根磨成4mm×4mm大小、0.5mm厚(只磨除牙本質(zhì)側(cè)，牙骨質(zhì)側(cè)不磨)的根片，經(jīng)高壓后置入DMEM培養(yǎng)液中浸泡48h后待用。

1.2. 3 PRP的制備^⑤取新鮮全血(已加入抗凝劑)經(jīng)2次離心提取PRP，第1次1300r/min離心10min，吸取全部上清液及交界面以下1～2mm的紅細(xì)胞至另一離心管,棄去下層的紅細(xì)胞，再次2000r/min離心10min，下層為PRP，將PRP保存在-20℃冰箱待用，制作全過程嚴(yán)格無菌。

1.2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為脫礦組(24%的EDTA處理2min，DMEM沖洗3遍后自然干燥)和未脫礦組(將準(zhǔn)備好的根片直接用于實(shí)驗(yàn))，脫礦和未脫礦的根片再分別用或不用PRP包被。將脫礦和未脫礦的根片用3mm×3mm的雙面膠固定在48孔板中，每組設(shè)3個(gè)樣本，放入超凈臺(tái)中紫外光照射2h，實(shí)驗(yàn)組根片包被20μL的PRP,對照組不包被PRP，操作時(shí)保持無菌，取5～8代的牙周膜成纖維細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104/mL,將細(xì)胞以每孔500μL接種于含根片的48孔板中，再于每孔中加入含2%FBS的DMEM培養(yǎng)液500μL，CO2孵箱內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下培養(yǎng)24h。24h后取出48孔板，用小鑷子小心夾出根片放入另一塊有PBS液的48孔板中輕輕漂洗后放入一潔凈的96孔板中，每孔加入200μL的0.125g/L的胰蛋白酶消化5min，吸出消化液放入1.5mL的EP管中，將根片用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液400μL反復(fù)沖洗3遍，沖洗液均收集于EP管中，將收集到根片上附著細(xì)胞的EP管以800～1000r/min離心5min，棄上清液，將收集到的細(xì)胞懸浮在200μL的培養(yǎng)液中，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)根片上所附著的細(xì)胞數(shù)，換算出每平方毫米根片上的細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色實(shí)驗(yàn)根片固定和處理同細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)，每孔接種細(xì)胞1.5×104個(gè)，分別于24h和48h后取出根片輕輕漂洗去除根面未附著的細(xì)胞，每孔加入200μL0.125g/L的胰蛋白酶消化5min，吸出消化液放入另一潔凈的48孔板中，將根片用不含血清的DMEN培養(yǎng)液反復(fù)沖洗3遍，沖洗液收集到一潔凈的48孔板中，每孔中加入MTT液20μL后將48孔板放入CO2孵箱內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育，4h后取出48孔板于每孔中加入150μL的二甲基亞砜不斷震蕩15min后放入ELX800酶聯(lián)免疫檢測儀中讀取光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS11.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析(onewayanalysisofvariance,ANOVA)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2、結(jié)果

2.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

未處理組、單純脫礦組、單純PRP組、脫礦PRP組PDLF對病變根面的附著數(shù)分別為(251.74±15.03)、(312.50±26.04)、(347.22±30.07)、(485.96±29.81)細(xì)胞/mm2(24h)，單純脫礦組、單純PRP組、脫礦PRP組均明顯高于未處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～0.01)。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

未處理組牙周膜成纖維細(xì)胞48h的OD值明顯低于24h的OD值(P<0.05)，脫礦PRP組48h的OD值明顯高于24h的OD值(P<0.05)。不同處理組牙周膜成纖維細(xì)胞增殖的時(shí)間效應(yīng)注：同組間與24h的OD值相比，P<0.05。

3、討論

用酸性藥物對根面平整后的病變根面進(jìn)行脫礦處理是臨床牙周手術(shù)中常用的根面處理方法，用于根面處理的物質(zhì)還有多種，如用四環(huán)素類藥物或各種生長因子(如TGFβ和PDGF)等處理根面，還有將釉基質(zhì)蛋白用于臨床牙周手術(shù)中取得了再生的效果。研究表明用EDTA處理根面是一種有效的獲得牙周組織再生的方法^⑥。PRP因含多種生長因子,其促進(jìn)牙周再生和修復(fù)的的作用日益受到學(xué)者們的重視,Kawase等^⑦研究表明來源于PRP的纖維蛋白能促進(jìn)體外培養(yǎng)的牙周膜成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的膠原合成。本實(shí)驗(yàn)中牙周病累及的病變根面未經(jīng)處理，細(xì)胞的附著數(shù)較處理組明顯減少，且隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞不但不增殖反而下降，經(jīng)EDTA處理后再用PRP包被，牙周膜成纖維細(xì)胞的附著和增殖明顯增強(qiáng)，分析原因可能為既有EDTA去除了玷污層，中和了毒素，消除了殘留的毒素對細(xì)胞的抑制作用，同時(shí)又有PRP中生長因子的促增殖效應(yīng)，可以推測PRP中的生物活性因子具有促牙周膜成纖維細(xì)胞附著和生長的潛能。關(guān)于PRP促進(jìn)牙周再生的確切機(jī)制以及PRP在牙周治療中應(yīng)用的可靠性仍需進(jìn)一步研究。

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