【摘要】目的：建立細(xì)菌及其產(chǎn)生的內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠分泌性中耳炎模型，并探討中耳黏膜中分泌型黏蛋白的表達(dá)，及其對(duì)中耳積液產(chǎn)生和發(fā)展造成的影響。方法：20只SD健康大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(10只)和實(shí)驗(yàn)組(10只);實(shí)驗(yàn)組建立滅活的流感嗜血桿菌引起的分泌性中耳炎模型，在不同時(shí)間段以鱟實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)中耳積液中的內(nèi)毒素，ELISA法檢測(cè)中耳積液中的黏蛋白。對(duì)取材黏膜常規(guī)染色和APPAS染色，觀察黏液腺、杯狀細(xì)胞。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組中鼓室上皮黏膜內(nèi)毒素含量平均值是對(duì)照組鼓室上皮黏膜中含量的2.1倍，其平均值差異有顯著性(P<0.05)。ELISA法檢測(cè)中耳積液中的黏蛋白，實(shí)驗(yàn)組鼓室上皮黏膜中平均值是對(duì)照組中平均值的4.2倍，其平均值差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)論：細(xì)菌的分解產(chǎn)物—內(nèi)毒素，導(dǎo)致中耳黏膜的炎癥反應(yīng)及中耳腔滲出，引起杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白，從而導(dǎo)致產(chǎn)生中耳積液，甚至膠耳。

【關(guān)鍵詞】黏蛋白;分泌性中耳炎;內(nèi)毒素

分泌性中耳炎(OME)是指中耳腔存在積液而不伴有急性感染癥狀或體征的一類(lèi)疾病。本病好發(fā)于兒童，特別是那些頑固性或持續(xù)性O(shè)ME，患兒因聽(tīng)力障礙可能導(dǎo)致言語(yǔ)發(fā)育遲緩、學(xué)習(xí)障礙及心理、行為異常，因而引起廣泛重視^①。由于OME的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，因此其治療效果尚難以令人滿意。

目前認(rèn)為，引起OME的病因是多因素的，包括咽鼓管功能障礙、感染和變態(tài)反應(yīng)等，但目前對(duì)其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。而黏膜高分泌引起的中耳腔出現(xiàn)不易清除的黏液是其主要特征。本實(shí)驗(yàn)旨在探討分泌性中耳炎的始動(dòng)因素，從引起中耳炎最常見(jiàn)的致病菌著手，研究細(xì)菌及其產(chǎn)生的內(nèi)毒素如何影響中耳黏膜黏蛋白的分泌;揭示內(nèi)毒素和黏蛋白在分泌性中耳炎積液的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中所起的作用，以便深入認(rèn)識(shí)分泌性中耳炎的發(fā)病機(jī)制，為臨床早期診治提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為分泌性中耳炎的預(yù)防和兒童聽(tīng)力保護(hù)做出有益探索，為其臨床治療提供新思路。

1、資料與方法

1.1 一般資料

選擇健康SD大鼠20只，雌雄不拘，體重200～250mg，電耳鏡檢查除外中耳疾患。隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組選擇分泌性中耳炎最常見(jiàn)的病原菌——滅活的流感嗜血桿菌，以1%戊巴比妥(30mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉后，經(jīng)鼓膜前下方注入細(xì)菌懸浮液0.1mL，注射前在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，保證沒(méi)有活的菌株生長(zhǎng)，以防引起急性感染;對(duì)照組注入等量生理鹽水。

1.2 研究方法

術(shù)后1，3，7，14，18d用1%苯巴比妥鈉將大鼠全麻，在手術(shù)顯微鏡下觀察鼓膜形態(tài)、顏色和色澤，之后隨機(jī)處死兩組中2只大鼠，取雙側(cè)聽(tīng)泡，用10%甲醛固定后脫鞘，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色光鏡下觀察，取小塊黏膜組織送電鏡檢查。黏膜常規(guī)染色和APPAS染色，觀察黏液腺、杯狀細(xì)胞。在不同時(shí)間段以鱟實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)中耳積液中的內(nèi)毒素，ELISA法檢測(cè)中耳積液中的黏蛋白。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以計(jì)算機(jī)輔助三維測(cè)量法分析組織學(xué)結(jié)果。所有統(tǒng)計(jì)資料由SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2、結(jié)果

觀察鼓膜情況：正常大鼠的鼓膜透亮，鼓室無(wú)積液，錘骨柄和光錐清晰可辨;造模后大鼠的鼓膜混濁，鼓室積液，光錐消失。

術(shù)后1d，APPAS染色正常組和對(duì)照組中耳黏膜鼓岬處由立方或扁平上皮和薄層結(jié)締組織(固有層)組成，黏膜下層有少數(shù)纖維母細(xì)胞和少許膠原纖維以及中性多核白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，光鏡下所有模型組咽鼓管上皮層次增多，黏液腺體擴(kuò)張、數(shù)目增多，小血管明顯充血并有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和大量增多的分泌細(xì)胞。術(shù)后1周模型組鼓室黏膜上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞明顯增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，電鏡下可見(jiàn)大量杯狀(分泌)細(xì)胞集結(jié)，表面有微絨毛，細(xì)胞內(nèi)有大量成熟的亮顆粒和少許暗顆粒，部分排放到黏膜表面，呈游離的團(tuán)狀，上皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體變形，核固縮或整個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，黏膜下毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，明顯增生。術(shù)后2周組和4周組出現(xiàn)成纖維細(xì)胞增生，有許多纖維母細(xì)胞和膠原纖維，新生血管增多，單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，中耳黏膜明顯增厚，在細(xì)胞間和黏膜下層有許多黏液細(xì)胞和黏液滴。

術(shù)后1，3，7，14，18d以鱟實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)中耳積液中的內(nèi)毒素，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組中內(nèi)毒素含量隨時(shí)間的增加而增加，平均值為(218.0±191.9)μg/106，是對(duì)照組鼓室上皮黏膜(101.57±653.4)μg/106的2.1倍，其平均值差異有顯著性(P<0.05)。ELISA法檢測(cè)中耳積液中的黏蛋白，實(shí)驗(yàn)組鼓室上皮黏膜中平均值為(4918.0±1931.9)μg/106，是對(duì)照組鼓室上皮黏膜中平均值(1001.45±263.8)μg/106的4.2倍，其平均值差異有顯著性(P<0.05)。

3、討論

分泌性中耳炎是耳鼻咽喉科常見(jiàn)病之一，是小兒聽(tīng)力障礙的主要原因，嚴(yán)重影響患兒的語(yǔ)言發(fā)育和智力發(fā)育。尤其是慢性分泌性中耳炎，病程長(zhǎng)，遷延不愈，如不及時(shí)治療則易導(dǎo)致鼓膜萎縮、鼓室硬化、慢性中耳炎、膽脂瘤、膽固醇肉芽腫等。其發(fā)病與中耳黏膜腺體和杯狀細(xì)胞的增生有關(guān)，黏膜高分泌引起的中耳腔出現(xiàn)不易清除的黏液是其主要特征^②。黏蛋白是黏液的主要成分，是一種高度糖基化的大分子蛋白質(zhì)，目前研究認(rèn)為其高表達(dá)與中耳炎發(fā)病關(guān)系密切。

到目前為止，人體中至少有9種不同的黏蛋白已被確認(rèn)，按其發(fā)現(xiàn)順序命名為MUC1～4，MUC5AC，MUC5B，MUC6～8^③⑧。MUC1，MUC3和MUC4屬于膜結(jié)合型黏蛋白;MUC2，MUC5AC，MUC5B和MUC6屬于分泌型黏蛋白;MUC8尚未確定?，F(xiàn)已證明MUC2，MUC5AC，MUC5B和MUC6黏蛋白的基因定位于染色體11P15.5，人們認(rèn)為它們來(lái)源于同一原始基因，因此它們具有結(jié)構(gòu)和基因序列的相似性。MCUI定位于染色體1q21～24，MUC3定位于染色體7q22，MUC4定位于3q29，MUC7定位于4q13～21，MUC8定位于12q24.3^⑨。由于黏蛋白基因的激活和滅活具有器官特異性和上皮細(xì)胞特異性，因此某種特定的上皮細(xì)胞其黏蛋白基因表達(dá)模式不同。

從總體看，黏蛋白可被分成兩組：一組為分泌型黏蛋白(MUC2，MUC5B，MUC5AC，MUC6)，它以膠體形式存在于黏膜表面，其基因編碼簇位于11P15染色體上。另一組為膜結(jié)合型黏蛋白，存在于上皮細(xì)胞的表層，MUC1，MUC3，MUC4均以跨膜形式存在。黏蛋白是由杯狀細(xì)胞分泌的，分布在上皮的表面，與細(xì)胞黏附、細(xì)胞保護(hù)、管腔表面潤(rùn)滑、入侵微生物的捕獲以及腫瘤生物學(xué)等有關(guān)。黏蛋白多肽骨架的氨基酸序列有以下特點(diǎn)：高度串聯(lián)重復(fù)氨基酸序列組成的結(jié)構(gòu)域占極高比例;重復(fù)單位富含具羥基側(cè)鏈的絲氨酸和蘇氨酸;重復(fù)單位的兩側(cè)(N和C端)富含半胱氨酸。成熟的黏蛋白羥基側(cè)鏈糖基化后形成O連接寡糖的糖蛋白;黏蛋白亞單位之間還可以通過(guò)半胱氨酸殘基的巰基(HS)側(cè)鏈相互作用形成二硫鍵，構(gòu)成黏蛋白聚合體，使得黏液具有膠狀特點(diǎn)^⑩。其中MUC1，MUC4和MUC5AC的表達(dá)始終局限于表面上皮細(xì)胞，前兩者(為膜結(jié)合型黏蛋白)表達(dá)于杯狀和纖毛細(xì)胞，MUC5AC只在杯狀細(xì)胞表達(dá)。

內(nèi)毒素是細(xì)菌死亡時(shí)釋放出的一種具有生物活性的物質(zhì)。它的主要成分為脂多糖，能引起中耳黏膜結(jié)締組織增生，細(xì)胞密度增大，毛細(xì)血管通透性增高，腺體及杯狀細(xì)胞分泌增加，破壞正常黏膜運(yùn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)，促進(jìn)中耳積液的蓄積，導(dǎo)致分泌性中耳炎遷延不愈。Yanagihara等^⑾報(bào)道，向大鼠氣管內(nèi)滴入綠膿假單胞菌內(nèi)毒素，引起大量的中性粒細(xì)胞募集和廣泛的氣道上皮細(xì)胞表型的改變，即有大量的黏液細(xì)胞的增生與化生，MUC5ACmRNA表達(dá)和蛋白分泌均增高。此外內(nèi)毒素也可經(jīng)過(guò)經(jīng)典途徑及替補(bǔ)途徑激活補(bǔ)體，使嗜堿性粒細(xì)胞或肥大細(xì)胞釋放組織胺、5羥色胺、激肽和其他血管活性介質(zhì)作用于靶細(xì)胞，從而引起血管擴(kuò)張，毛細(xì)血管通透性增加，同時(shí)趨化因子能吸引白細(xì)胞向炎癥病灶部位聚集，促進(jìn)吞噬。在發(fā)揮吞噬作用的過(guò)程中，釋放溶酶體酶等生物活性物質(zhì)，除破壞抗原性異物外，同時(shí)也可損傷鄰近組織和加劇炎癥，參與分泌性中耳炎的發(fā)病。本研究表明：細(xì)菌感染引起的分泌性中耳炎中，鼓室黏膜內(nèi)毒素的含量及杯狀細(xì)胞明顯增多，黏蛋白的分泌也明顯增加。這與上述文獻(xiàn)相符，說(shuō)明內(nèi)毒素可能是導(dǎo)致分泌性中耳炎出現(xiàn)黏性滲液的始動(dòng)因素;在急性中耳炎發(fā)展為慢性分泌性中耳炎過(guò)程中，中耳積液與內(nèi)毒素和黏蛋白含量存在某種關(guān)聯(lián)。由此推斷，針對(duì)某一特定時(shí)期使用降解內(nèi)毒素的藥物，可以提高機(jī)體對(duì)內(nèi)毒素耐受力的糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物，有助于減輕內(nèi)毒素對(duì)中耳黏膜的損害，并消除中耳滲液。抗流感嗜血桿菌抗體對(duì)流感嗜血桿菌引起的中耳炎可能具有保護(hù)作用。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Orlin M N,Effgen S K,Handler S D.Effect of otitis media with effusion on gross motor ability in preschool aged children:preliminary findings[J].Pediatrics,1997,99(3):334 337.

[2]Nell M J,Grote J J.Structural changes in the rat middle ear mucosa due to endotoxin and eustachian tube obstruction[J].Ear Arch Otorhinolaryngol,1999,256(4):167 172.

[3]Gum J R,Byrd J C,Hicks J W,et al.Molecular cloning of human intestinal mucin cDNAs,sequence analysis and evidence for genetic polymorphism[J].Biol Chem,1989,264:6 480 6 487.

[4]Gum J R,Hicks J W,Swallow D M,et al.Molecular cloning of cDNAs derived from a novel human intestinal mucin gene[J].Biochem Biophys Res Commun,1990,171(1):407 415.

[5]Bobek L A,Tsai H,Biesbrock A R,et al.Molecular cloning,sequence and specificity of expression of the gene encoding the low molecular weight human salivary mucin(MUC7)[J].Biol Chem,1993,268(27):20 563 20 569.

[6]Ho S B,Roberton A M,Shekels L L,et al.Expres sion cloning of gastric mucin complementary DNA and localization of mucin gene expression[J].Gastroenterology,1995,109(3):735 747.

[7]Keates A C,Neues D P,Afdhal N H,et al.Molecular cloning of a major human gall bladder mucin:complete c terminal sequence and genomic organization of MUC5[J].Biochem,1997,324:295 303.

[8]Shankar V,Pichan P,Eddy R L,et al.Chromosomal localization of a human mucin gene(MUC8) and cloning CDNA corresponding to the carboxy terminus[J].Am J Pespir Cell Mol Biol,1997,16(3):232 241.

[9]Nollet S,Moniaux N,Maury J,et al.Human mucin gene MUC4:organization of its 5′ region and polymorphism of its central tandem repeat array[J].Biochem,1998,332(3):739 748.

[10]Moniaux N,Escande F,Porchet N,et al.Structural organization and classification of the human mucin genes[J].Front Biosci,2001,6:1 192 1 206.

[11]Yanagihara K,Seki M,Cheng P W.Lipopolysaccharide induces mucus cell metaplasia in mouse lung[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2001,24(1):66 73.